كيف يعمل تفاعل سلسلة البلمرة لتضخيم الجينات

تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هي تقنية جينية جزيئية لعمل نسخ متعددة من الجين وهي أيضًا جزء من عملية تسلسل الجينات.

يتم عمل النسخ الجينية باستخدام عينة من DNA ، والتقنية جيدة بما يكفي لعمل نسخ متعددة من نسخة واحدة من الجين الموجود في العينة. تضخيم PCR للجين لعمل الملايين من النسخ ، يسمح لكشف وتحديد تسلسل الجينات باستخدام تقنيات بصرية تعتمد على حجم وشحنة (+ أو -) قطعة من DNA.

في ظل ظروف خاضعة للرقابة ، يتم إنشاء أجزاء صغيرة من DNA بواسطة إنزيمات تعرف باسم polymerases DNA ، والتي تضيف deoxynucleotides مجانًا (dNTPs) إلى قطعة من الحمض النووي تعرف باسم "القالب". حتى قطع صغيرة من الحمض النووي ، تسمى "الاشعال" تستخدم كنقطة انطلاق لل البلمرة.

البرايمر عبارة عن قطع صغيرة من الحمض النووي (أوليغوميرات) ، عادة ما يتراوح طولها بين 15 و 30 نيوكليوتيد. يتم إجراؤها عن طريق معرفة أو تخمين تسلسلات DNA قصيرة في نهايات الجين التي يتم تضخيمها. أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، يتم تسخين الحمض النووي المتسلسل ويتم فصل الخيوط المزدوجة. عند التبريد ، ترتبط البادئات بالقالب (تسمى التلدين) وتخلق مكانًا لبدء البلمرة.

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أصبح ممكنا من خلال اكتشاف محبي الحرارة و محبي الحرارة إنزيمات البوليميراز (الإنزيمات التي تحافظ على السلامة الهيكلية والوظائف بعد التسخين عند ارتفاع درجات الحرارة). الخطوات المتبعة في تقنية PCR هي كما يلي:

• يتم إنشاء خليط ، مع تركيزات محسنة من قالب الحمض النووي ، وإنزيم البلمرة ، والبادئات ، و dNTPs. القدرة على تسخين الخليط دون تشويه الإنزيم يسمح بإفساد اللولب المزدوج لعينة الحمض النووي عند درجات حرارة تتراوح بين 94 درجة درجة مئوية.
• بعد التمسخ ، يتم تبريد العينة إلى نطاق أكثر اعتدالًا ، حوالي 54 درجة ، مما يسهل تلدين (ربط) البادئات إلى قوالب الحمض النووي أحادية الشريط.
• في الخطوة الثالثة من الدورة ، يتم إعادة تسخين العينة إلى 72 درجة ، وهي درجة الحرارة المثالية لـ Taq DNA Polymerase ، للاستطالة. أثناء الاستطالة ، يستخدم بوليميراز الدنا الشريط الأصلي الوحيد للحمض النووي كقالب لإضافة dNTPs التكميلية إلى نهايات 3 'لكل برايمر وإنشاء قسم من DNA مزدوج الشرائط في منطقة الجين المعني.
• لا تبقى مواد التمهيدي التي تلقت تسلسلات DNA التي لا تتطابق تمامًا عند درجة 72 ، مما يقصر الاستطالة على الجين المعني.

تتكرر عملية التشويه والتليين والاستطالة عدة مرات (30-40) ، وبالتالي زيادة عدد نسخ الجين المطلوب في الخليط بشكل كبير. على الرغم من أن هذه العملية ستكون مملة للغاية إذا تم إجراؤها يدويًا ، يمكن تحضير العينات واحتضانها في Thermocycler قابل للبرمجة ، شائع الآن في معظم المختبرات الجزيئية ، ويمكن إجراء تفاعل PCR كامل في 3-4 ساعات.

تؤدي كل خطوة من خطوات التشويه إلى إيقاف عملية الاستطالة للدورة السابقة ، وبالتالي اقتطاع الخيط الجديد للحمض النووي والحفاظ على حجم الجين المطلوب تقريبًا. يمكن جعل مدة دورة الاستطالة أطول أو أقصر اعتمادًا على حجم الجين المعني ، ولكن في النهاية ، من خلال دورات متكررة من PCR ، ستقتصر معظم القوالب على حجم الجين محل الاهتمام فقط ، حيث سيتم إنشاؤها من منتجات كل من الاشعال.

هناك العديد من الاختلافات عوامل نجاح PCR التي يمكن التلاعب بها لتحسين النتائج. الطريقة الأكثر استخدامًا لاختبار وجود منتج PCR هي الاغاروز الكهربائي للهلام. والذي يستخدم لفصل أجزاء الحمض النووي بناءً على الحجم والشحنة. ثم يتم تصور الأجزاء باستخدام الأصباغ أو النظائر المشعة.

منذ اكتشاف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، تم اكتشاف بوليميرازات DNA غير طق الأصلي. يتمتع بعضها بقدرة "تدقيق تدقيق" أفضل أو يكون أكثر ثباتًا في درجات الحرارة المرتفعة ، وبالتالي تحسين خصوصية PCR وتقليل الأخطاء من إدخال dNTP غير الصحيح.

تم تصميم بعض الاختلافات في تفاعل البوليميراز المتسلسل لتطبيقات محددة وتستخدم الآن بشكل منتظم في المختبرات الوراثية الجزيئية. بعض هذه هي PCR في الوقت الحقيقي و PCR عكس النسخ. أدى اكتشاف PCR أيضًا إلى تطوير تسلسل الحمض النووي ، بصمة الحمض النووي والتقنيات الجزيئية الأخرى.