طرق تنقية البروتين في التكنولوجيا الحيوية

يعد استخدام تقنيات هندسة البروتين لتصميم أو تعديل البروتينات أحد المكونات الهامة لأبحاث التكنولوجيا الحيوية. تعمل تقنيات تنقية البروتين هذه على تحسين خصائص البروتين لتطبيقات صناعية محددة.

تتطلب هذه التقنيات من العلماء عزل وتنقية البروتينات ذات الأهمية بحيث يمكن دراسة تطابقها وخصائصها. تتطلب الدراسة أيضًا التفاعلات مع الروابط الأخرى (بروتين يرتبط ببروتين المستقبل) وأنشطة إنزيمية محددة.

تعتمد درجة نقاء البروتين المطلوبة على الاستخدام النهائي المقصود للبروتين. بالنسبة لبعض التطبيقات ، يكفي استخراج الخام. الاستخدامات الأخرى ، كما هو الحال في الأطعمة والأدوية ، مطلوب مستوى عال من النقاء. تقنيات عديدة ل تنقية البروتين يتم استخدامها للوصول إلى مستوى النقاء المطلوب.

عادةً ما تؤدي كل خطوة من خطوات تنقية البروتين إلى فقدان درجة ما من المنتج. لذلك ، فإن استراتيجية تنقية البروتين المثالية هي تلك التي يتم فيها الوصول إلى أعلى مستوى من التنقية في أقل عدد من الخطوات.

يعتمد اختيار الخطوات المطلوب استخدامها على حجم البروتين المستهدف وشحنه وقابليته للذوبان وخصائصه الأخرى. التقنيات التالية هي الأنسب لتنقية بروتين خلوي واحد.

تنقية مجمعات البروتين الخلوي أكثر تعقيدًا وتتطلب عادةً تطبيق طرق مختلفة.

الخطوة الأولى في تنقية بروتينات الخلايا (داخل الخلية) هي تحضير مستخلص خام. سيحتوي المستخلص على مزيج معقد من جميع البروتينات من الخلية السيتوبلازمية ، وبعض الجزيئات الضخمة ، والعوامل المساعدة ، والمغذيات.

يمكن استخدام هذا المستخلص الخام لبعض التطبيقات في مجال التكنولوجيا الحيوية. ومع ذلك ، إذا كانت النقاء مشكلة ، فيجب اتباع خطوات التنقية اللاحقة. يتم تحضير مستخلصات البروتين الخام عن طريق إزالة الحطام الخلوي الناتج عن تحلل الخلية ، والذي يتحقق باستخدام المواد الكيميائية ، الإنزيماتالصوتنة أو الصحافة الفرنسية.

تتم إزالة الحطام بالطرد المركزي ، ويتم استعادة المادة الطافية (السائل فوق بقايا صلبة). يمكن الحصول على المستحضرات الخام للبروتينات خارج الخلية (خارج الخلية) ببساطة عن طريق إزالة الخلايا بالطرد المركزي.

مؤكد التكنولوجيا الحيوية التطبيقات ، هناك طلب على الإنزيمات القابلة للحرارة - الإنزيمات التي يمكن أن تتحمل درجات الحرارة العالية دون التشويه ، مع الحفاظ على نشاط محدد مرتفع.

تسمى الكائنات التي تنتج بروتينات مقاومة للحرارة أحيانًا بالمتطرفة. من الطرق السهلة لتنقية بروتين مقاوم للحرارة إزالة البروتينات الأخرى في الخليط تسخين ، ثم تبريد المحلول (وبالتالي السماح للإنزيم الحراري بإصلاح أو إعادة الذوبان ، إذا ضروري). يمكن بعد ذلك إزالة البروتينات المشوهة عن طريق الطرد المركزي.

عصري التكنولوجيا الحيوية غالبًا ما تستفيد البروتوكولات من العديد من المجموعات أو الطرق المتاحة تجاريًا التي توفر حلولًا جاهزة للإجراءات القياسية. غالبًا ما يتم تنقية البروتين باستخدام المرشحات وأعمدة ترشيح الهلام المعدة.

اتبع تعليمات مجموعة غسيل الكلى وأضف الحجم الصحيح للحل الصحيح وانتظر طول الوقت المحدد أثناء جمع المادة (يمر المذيب عبر العمود) في اختبار جديد الة النفخ.

يمكن تطبيق طرق الكروماتوغرافي باستخدام أعمدة منضدة أعلى أو معدات أتوماتيكية HPLC. يمكن أن يتم الفصل بواسطة HPLC عن طريق الطور العكسي ، أو تبادل الأيونات أو طرق استبعاد الحجم ، والعينات التي تم الكشف عنها بواسطة مجموعة الصمام الثنائي أو تقنية الليزر.

في الماضي ، كانت الخطوة الثانية الشائعة لتنقية بروتين من مستخلص خام عن طريق الترسيب في محلول ذو قوة تناضحية عالية (أي محاليل الملح). عادة ما يتم ترسيب البروتين باستخدام كبريتات الأمونيوم كملح. يمكن إزالة الأحماض النووية في المستخلص الخام عن طريق ترسيب الركام المتكون من كبريتات الستربتوميسين أو كبريتات البروتامين.

لا يؤدي ترسيب الملح عادة إلى بروتين عالي النقاء ولكنه يمكن أن يساعد في القضاء على بعض البروتينات غير المرغوب فيها في الخليط ، وتركيز العينة. ثم تتم إزالة الأملاح في المحلول عن طريق غسيل الكلى من خلال أنابيب السليلوز المسامية ، والترشيح ، أو اللوني استبعاد الجل.

سوف تترسب بروتينات مختلفة بتركيزات مختلفة من كبريتات الأمونيوم. بشكل عام ، تترسب البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي بتركيزات أقل من كبريتات الأمونيوم.

يفصل كروماتوغرافيا الطور العكسي (RPC) البروتينات بناءً على كراهية الماء النسبية (استبعاد الجزيئات غير القطبية من الماء). هذه التقنية انتقائية للغاية ولكنها تتطلب استخدام المذيبات العضوية.

يتم تشويه بعض البروتينات بشكل دائم بواسطة المذيبات وستفقد وظيفتها أثناء RPC. لذلك لا يوصى بهذه الطريقة لجميع التطبيقات ، خاصة إذا كان من الضروري أن يحتفظ البروتين المستهدف بالنشاط.

يشير كروماتوغرافيا التبادل الأيوني إلى فصل البروتينات بناءً على الشحنة. يمكن تحضير الأعمدة إما للتبادل الأيوني أو الكاتيوني. تحتوي أعمدة التبادل الأنيوني على طور ثابت مع شحنة موجبة تجذب البروتينات المشحونة سلبًا.

أعمدة تبادل الكاتيون هي حبات عكسية سالبة تجذب البروتينات المشحونة بشكل إيجابي. يتم شطف (استخلاص مادة من أخرى) من البروتين (البروتينات) المستهدف عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني العمود ، مما يؤدي إلى تغيير أو تحييد المجموعات الوظيفية المشحونة لكل منها بروتين.

فصل كروماتوغرافيا الإقصاء الحجمي (المعروف أيضًا باسم ترشيح الهلام) يفصل البروتينات الكبيرة عن الأصغر حيث أن الجزيئات الأكبر تنتقل أسرع عبر البوليمر المتصالب في الكروماتوغرافيا عمود. لا تتناسب البروتينات الكبيرة مع مسام البوليمر في حين أن البروتينات الأصغر تفعل ، وتستغرق وقتًا أطول للتنقل عبر عمود اللوني عبر طريق أقل مباشرة.

يتم شطف (نتيجة الشطف) في سلسلة من الأنابيب التي تفصل البروتينات على أساس وقت الشطف. ترشيح الجل هو أداة مفيدة لتركيز عينة البروتين حيث يتم جمع البروتين المستهدف في حجم شطف أصغر مما تم إضافته في البداية إلى العمود. يمكن استخدام تقنيات ترشيح مماثلة أثناء إنتاج البروتين على نطاق واسع بسبب فعاليتها من حيث التكلفة.

يعد كروماتوغرافيا التقارب تقنية مفيدة جدًا في "التلميع" ، أو إكمال عملية تنقية البروتين. ترتبط الخرزات في عمود اللوني ارتباطًا متقاطعًا بالرباطات التي ترتبط بشكل خاص بالبروتين المستهدف.

ثم تتم إزالة البروتين من العمود عن طريق شطفه بمحلول يحتوي على ليجندات مجانية. تعطي هذه الطريقة أفضل النتائج وأعلى نشاط محدد مقارنة بالتقنيات الأخرى.

يرتبط SDS-PAGE (كبريتات دوديسيل الصوديوم المستخدمة مع الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد) بالبروتينات مما يمنحها شحنة سالبة كبيرة صافية. بما أن شحنات جميع البروتينات متساوية إلى حد ما ، فإن هذه الطريقة تفصلها بالكامل تقريبًا بناءً على الحجم.

غالبًا ما يُستخدم SDS-PAGE لاختبار نقاء البروتين بعد كل خطوة في السلسلة. نظرًا لأن البروتينات غير المرغوب فيها تتم إزالتها تدريجيًا من الخليط ، يتم تقليل عدد العصابات المرئية على هلام SDS-PAGE ، حتى يكون هناك نطاق واحد فقط يمثل البروتين المطلوب.

Immunoblotting عبارة عن تقنية لتصور البروتين يتم تطبيقها بالاشتراك مع كروماتوغرافيا الألفة. يتم استخدام الأجسام المضادة لبروتين معين كرباطات في عمود اللوني تقارب.

يتم الاحتفاظ بالبروتين المستهدف على العمود ، ثم يتم إزالته بشطف العمود بمحلول ملح أو عوامل أخرى. تساعد الأجسام المضادة المرتبطة بالتسميات المشعة أو الصبغية في الكشف عن البروتين المستهدف بمجرد فصله عن باقي الخليط.