تقنيات تسلسل الحمض النووي

في مجال التكنولوجيا الحيوية هي واحدة من التغيير المستمر. يعتمد النمو والتطور السريع للبحوث المتطورة على الابتكار والإبداع العلماء وقدرتهم على رؤية الإمكانات في تقنية جزيئية أساسية وتطبيقها على الجديد العمليات. ظهور تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) فتحت أبوابًا عديدة في البحث الجيني ، بما في ذلك وسيلة تحليل الحمض النووي وتحديد الجينات المختلفة بناءً على تسلسل الحمض النووي. يعتمد تسلسل الحمض النووي أيضًا على قدرتنا على الاستخدام هلام الكهربائي لفصل خيوط من DNA تختلف في الحجم بمقدار زوج أساسي واحد.

في أواخر السبعينيات ، تم اختراع طريقتين لتسلسل الحمض النووي لجزيئات الحمض النووي الأطول: طريقة سانجر (أو ديديوكسي) وطريقة ماكسام جيلبرت (الانقسام الكيميائي). تعتمد طريقة Maxam-Gilbert على الانقسام الخاص بالنيوكليوتيدات بواسطة المواد الكيميائية وأفضل استخدام لتسلسل النوكليوتيدات (بوليمرات النوكليوتيدات القصيرة ، عادة ما تكون أصغر من 50 زوجًا أساسيًا في الطول). يتم استخدام طريقة Sanger بشكل أكثر شيوعًا لأنه قد ثبت أنها أسهل من الناحية الفنية في التطبيق ، ومع ظهور PCR وأتمتة التقنية ، يتم تطبيقه بسهولة على خيوط طويلة من DNA بما في ذلك بعض الجينات. تعتمد هذه التقنية على إنهاء السلسلة بواسطة dideoxynucleotides أثناء تفاعلات استطالة PCR.

في طريقة Sanger ، يتم استخدام حبلا DNA ليتم تحليله كقالب ويتم استخدام polymerase DNA ، في تفاعل PCR ، لتكوين خيوط تكميلية باستخدام البادئات. يتم تحضير أربعة مخاليط تفاعل PCR مختلفة ، يحتوي كل منها على نسبة معينة من نظائر dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) لأحد النوكليوتيدات الأربعة (ATP أو CTP أو GTP أو TTP).

يستمر تخليق جديلة الحمض النووي الجديدة حتى يتم دمج أحد هذه النظائر ، وفي ذلك الوقت يتم قطع الخيط قبل الأوان. كل تفاعل PCR سينتهي به المطاف يحتوي على خليط من أطوال مختلفة من خيوط الحمض النووي ، وكلها تنتهي بالنيوكليوتيد الذي تم تصنيف dideoxy لهذا التفاعل. جل الكهربائي ثم يتم استخدامه لفصل خيوط التفاعلات الأربعة ، في أربعة ممرات منفصلة ، وتحديد تسلسل القالب الأصلي بناءً على أطوال الخيوط مع أي نيوكليوتيد.

في تفاعل Sanger الأوتوماتيكي ، يتم استخدام البادئات التي تحمل أربع علامات فلورية ملونة مختلفة. يتم إجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، في وجود ديوكسين نيوكليوتيدات مختلفة ، كما هو موضح أعلاه. ومع ذلك ، بعد ذلك ، يتم دمج مخاليط التفاعل الأربعة وتطبيقها على حارة واحدة من الجل. يتم الكشف عن لون كل جزء باستخدام شعاع الليزر ويتم جمع المعلومات بواسطة الكمبيوتر الذي يولد كروماتوجرام يظهر قمم لكل لون ، والتي يمكن أن يكون تسلسل الحمض النووي القالب منها تحدد.

عادةً ما تكون طريقة التسلسل الآلي دقيقة فقط للتسلسلات التي يصل طولها إلى حوالي 700-800 زوجًا أساسيًا في الطول. ومع ذلك ، من الممكن الحصول على تسلسلات كاملة من الجينات الأكبر ، وفي الواقع ، الجينوم الكامل ، باستخدام طرق متدرجة مثل Primer Walking وتسلسل Shotgun.

في Primer Walking ، يتم تسلسل جزء عملي من جين أكبر باستخدام طريقة Sanger. يتم إنشاء بادئات جديدة من قطعة موثوقة من التسلسل وتستخدم لمواصلة تسلسل جزء من الجين الذي كان خارج نطاق التفاعلات الأصلية.

يستلزم تسلسل البندقية قطع مقطع DNA موضع الاهتمام بشكل عشوائي إلى أكثر ملاءمة شظايا حجم (قابلة للإدارة) ، وتسلسل كل جزء ، وترتيب القطع على أساس التداخل تسلسل. تم تسهيل هذه التقنية من خلال تطبيق برامج الكمبيوتر لترتيب القطع المتداخلة.