إجراء صبغة جرام في علم الأحياء الدقيقة

صبغة جرام هي طريقة مختلفة للتلطيخ تستخدم للتعيين بكتيريا إلى واحدة من مجموعتين (إيجابية الجرام وسالبة الجرام) بناءً على خصائص جدران زنزاناتهم. يُعرف أيضًا باسم تلوين جرام أو طريقة جرام. تمت تسمية الإجراء للشخص الذي طور التقنية ، عالم الجراثيم الدنماركي هانز كريستيان غرام.

يعتمد الإجراء على التفاعل بين الببتيدوغليكان في جدران الخلايا لبعض البكتيريا. تتضمن صبغة غرام تلطيخ البكتيريا ، وتثبيت اللون باستخدام لون خفيف ، وإزالة لون الخلايا ، وتطبيق صبغة مضادة.

1. البقعة الأولية (الكريستال البنفسجي) يرتبط بالببتيدوجليكان ، خلايا التلوين الأرجواني. تحتوي كل من الخلايا الموجبة والسالبة للجرام على الببتيدوغليكان في جدران الخلايا ، لذلك في البداية ، كل البكتيريا تلطخ البنفسجي.
2. اليود غرام (اليود ويوديد البوتاسيوم) كمادة مثبتة أو مثبتة. تشكل الخلايا الإيجابية للجرام معقد كريستال بنفسجي اليود.
3. الكحول أو الأسيتون يستخدم لإزالة لون الخلايا. تحتوي البكتيريا سالبة الجرام على الببتيدوجليكان أقل بكثير في جدران خلاياها ، لذا فإن هذه الخطوة تجعلها عديمة اللون بشكل أساسي ، بينما تتم إزالة بعض الألوان فقط من الخلايا الإيجابية الغرام ، والتي تحتوي على المزيد من الببتيدوغليكان (60-90٪ من جدار الخلية). يتم تجفيف جدار الخلية السميكة للخلايا الموجبة للجرام من خلال خطوة إزالة اللون ، مما يتسبب في انكماشها وحبس مجمع اليود في الداخل.
   instagram viewer
4. بعد خطوة إزالة اللون ، يتم تطبيق بقعة مضادة (عادة ما تكون سافرانين ، ولكن في بعض الأحيان فوشين) لتلوين البكتيريا الوردية. تلتقط البكتيريا الموجبة والسالبة الجرام البقعة الوردية ، ولكنها غير مرئية على اللون الأرجواني الداكن للبكتيريا الموجبة للغرام. إذا تم إجراء عملية التلوين بشكل صحيح ، فستكون البكتيريا إيجابية الجرام أرجوانية ، بينما ستكون البكتيريا سلبية الغرام وردية.

يتم عرض نتائج صبغة جرام باستخدام المجهر الضوئي. لأن البكتيريا ملونة ، لم يتم تحديد مجموعة صبغات غرام فقط ، ولكن أيضًا شكلهايمكن ملاحظة الحجم والحجم ونمط التكتل. هذا يجعل صبغة غرام أداة تشخيصية قيمة لعيادة طبية أو مختبر. في حين أن البقعة قد لا تحدد البكتيريا بالتأكيد ، غالبًا ما تكون معرفة ما إذا كانت إيجابية الجرام أو سلبية الغرام كافية لوصف مضاد حيوي فعال.

قد تكون بعض البكتيريا متغيرة الجرام أو غير محددة الجرام. ومع ذلك ، حتى هذه المعلومات قد تكون مفيدة في تضييق الهوية البكتيرية. تكون التقنية أكثر موثوقية عندما يكون عمر الثقافات أقل من 24 ساعة. في حين أنه يمكن استخدامه في مزارع المرق ، فمن الأفضل طردهم أولاً. القيد الأساسي للتقنية هو أنها تعطي نتائج خاطئة إذا ارتكبت أخطاء في التقنية. هناك حاجة إلى الممارسة والمهارة لتحقيق نتيجة موثوقة. أيضا ، قد لا يكون العامل المعدي بكتيريا. مسببات الأمراض حقيقية النواة تلطخ سلبية الغرام. ومع ذلك ، معظم الخلايا حقيقية النواة باستثناء الفطريات (بما في ذلك الخميرة) لا تلتصق بالشريحة أثناء العملية.

• بنفسجي كريستالي (بقعة أساسية)
• اليود في غرام (mordant ، لإصلاح البنفسج البلوري في جدار الخلية)
• الإيثانول أو الأسيتون (مزيل اللون)
• Safranin (بقعة ثانوية أو بقعة مضادة)
• الماء في زجاجة بخ أو زجاجة بالقطارة
• شرائح المجهر
• المجهر المركب

1. ضع قطرة صغيرة من العينة البكتيرية على شريحة. قم بإصلاح البكتيريا في الشريحة عن طريق تمريرها من خلال لهب موقد بنسن ثلاث مرات. يمكن أن يؤدي استخدام الكثير من الحرارة أو لفترة طويلة جدًا إلى إذابة جدران الخلايا البكتيرية ، مما يؤدي إلى تشويه شكلها ويؤدي إلى نتيجة غير دقيقة. إذا تم تطبيق القليل من الحرارة ، فستغسل البكتيريا الشريحة أثناء التلوين.
2. استخدم قطارة لتطبيق البقعة الأساسية (البنفسجي الكريستالي) على الشريحة واتركها لمدة دقيقة واحدة. اشطف الشريحة برفق بالماء لمدة لا تزيد عن 5 ثوانٍ لإزالة البقع الزائدة. يمكن أن يؤدي الشطف لفترة طويلة إلى إزالة الكثير من الألوان ، في حين أن عدم الشطف لفترة كافية قد يسمح ببقاء الكثير من البقع على الخلايا سلبية الغرام.
3. استخدم قطارة لتطبيق يود غرام على الشريحة لتثبيت البنفسجي البلوري على جدار الخلية. اتركه لمدة 1 دقيقة.
4. اشطف الشريحة بالكحول أو الأسيتون لمدة 3 ثوانٍ تقريبًا ، واتبعها فورًا بشطف لطيف باستخدام الماء. ستفقد الخلايا سلبية الغرام اللون ، بينما ستبقى الخلايا الموجبة للجرام بنفسجية أو زرقاء. ومع ذلك ، إذا تم ترك مزيل اللون لفترة طويلة جدًا ، فستفقد كل الخلايا اللون!
5. ضع البقعة الثانوية والسافرانين واتركها لمدة 1 دقيقة. شطف بلطف بالماء لمدة لا تزيد عن 5 ثوان. يجب أن تكون الخلايا سلبية الغرام ملطخة باللون الأحمر أو الوردي ، في حين ستظل الخلايا الموجبة للجرام تظهر أرجوانية أو زرقاء.
6. عرض الشريحة باستخدام المجهر المركب. قد تكون هناك حاجة إلى تكبير من 500x إلى 1000x لتمييز شكل الخلية وترتيبها.

لا ترتبط جميع البكتيريا التي تم تحديدها بواسطة صبغة جرام بالأمراض ، ولكن بعض الأمثلة المهمة تشمل:

• المكورات إيجابية الجرام (جولة):المكورات العنقودية الذهبية
• المكورات سلبية الغرام:النيسرية السحائية
• عصيات إيجابية الجرام (قضبان): عصيات الجمرة الخبيثة
• عصيات سلبية الجرام:الإشريكية القولونية